玉米是当代农业中产量最高、最进击的植物之一，对玉米微生物组的谋划旨在通过了解生计在植物里面和名义的微生物种群的生态学，进一步进步其坐褥力和抗逆性图片专区，生计在植物体内的微生物被称为内生菌，鉴于两者之间的密切斗殴，可能对植物助长和健康产生告成影响。

同期生计在植物名义的微生物称为附生植物；那些生计在叶圈或叶名义的生物栖息在地球上最大的生物名义积，但生计在根名义和附着泥土（根际）上的细菌存在于营养和水的重要罗致部位。

谋划格局

植物通过根部分泌多种化合物到周围泥土中来喂养和垄断生计在那儿的微生物，从而影响其根际的微生物组成。这些分泌物代表植物能量和资源的滥用，共计高达植物固定碳的 40%，尽管拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门在这两个生态位中也很常见，但酸杆菌门和浮霉菌门仅在根际中常见。

诚然叶际细菌的发源仍然不解确，但内生细菌和根际细菌的发源;，传统上被以为来自泥土，与泥土发源违反，有字据标明玉米种子里面和/或名义的细菌内生菌组成了根内圈细菌种群的大部分，况兼至少其中一些细菌粗造在植物内传播，离开根部并在根际定殖。

访佛的字据标明，在水稻植物的内圈和根际微生物群中也发现了种子内生菌，而对助长在表露沙漠岩石上的卡东仙东说念主掌的谋划标明，幼苗依靠种子传播的细菌在根际定植，以匡助熔解岩石基质，匡助植物罗致营养。

敏锐分子指纹识别和经济实惠的下一代测序本领的出现激发了根际谋划的回复，好多对于玉米根际细菌万般性的新谋划、拟南芥根际和其他进击植物物种的根际。

为了更好地梳理玉米植物叶际、内层和根际细菌种群的发源偏激影响，在这项谋划中，咱们取得了两种不同的玉米基因型，并将它们汲引在三种人大不同的基质中，Lenha 场合品种是一种未经化学不休的种子，是一种来自巴西的陈腐、绽开授粉品种，具有粗棒棒子，之是以如斯定名，是因为据信土著东说念主民将它们用作柴火。

为了进行基因型对比，EMBRAPA 培育的杂交种 BRS 1030是从农药和杀菌剂包被的种子中培育出来的，代表了工业化农业中抗逆性和抗病性培育的优良品种，尽管已知这种罕见品种对接种故意细菌有响应。

这些不同的基因型在三种微生物人大不同的基质上助长，以谋划泥土当作根际、内圈或叶际微生物开首的才气，通过在高压釜中对石英砂反复加热灭菌，将其中一种基质当作微生物阴性对照，选用第二个基质来代表夙昔莫得斗殴过植物的泥土，况兼展望不含与植物关系的微生物；这种粉状底土取自巴西铁矿地下 400 m 处。

临了，为了不雅察富含营养和微生物的表土对玉米微生物组的影响，咱们取得了从马瑙斯市隔邻的巴西亚马逊森林内的一个考古功绩成绩的 terra preta do indio，

为了表征植物基因型和泥土基质对玉米微生物组的影响，将两种玉米基因型在温室中比肩汲引在三种基质中，通过索乞降扩增植物关系微生物生态位中的细菌 DNA，对通盘样品进行物种万般性分析，并使用来自 DNA 指纹本领的 16S rDNA 数据的主要素分析，末端片断长度多态性分析 (TRFLP) 相比细菌种群结构的变化。

另外还使用 16S rDNA 的 Miseq 分析谋划了根际 DNA。测序数据使咱们粗造测量不同系统型的丰采图片专区，使咱们粗造揣度玉米根际细菌种群的相对大小，咱们展望不雅察到叶际和根内圈细菌万般性受植物基因型的影响最大，而根际则主要由泥土传播的细菌组成，咱们盘问了成果以及数据对这些细菌种群发源的露出。

成绩叶际、根际和根内圈

为了谋划根和芽名义，将 5 叶阶段的通盘植物防备肠摇动，使其脱离任何泥土，在根/芽限制处切割，裁撤衰落的种子壳，进一步摇动根以裁撤任何可见的过剩泥土，然后将根和芽放入单独的无菌 50 mL 锥形管中。

40 ml 无菌 50 mM Na 2 HPO 4将含有 0.1% Tween 20 的缓冲液添加到每个管中，用手移时摇动，然后在 T7 型超声水浴中以 22.5 kHz 超声不休 10 分钟，以去除植物名义的泥土颗粒和微生物，然后将根际和叶际洗涤液在 4°C 下以 15，000 g 离心 15 分钟，生成千里淀，去除上清液，将千里淀悬浮于 4 mL 磷酸盐缓冲液中，然后冷冻以供后续 DNA 索求。

将根组织置于干净的锥形管中，并用无菌磷酸盐缓冲液进一步冲洗，直至在洗涤液中不再不雅察到污染，然后用 2.5% 次氯酸钠不休洗过的根，并如前所述超声不休 10 分钟，排出漂白剂，并用 2.5% 次氯酸钠相通不休并超声不休 10 分钟。

然后将样品沥干并用高压灭菌的蒸馏水冲洗，然后用 70% 酒精冲洗 10 分钟，裁撤酒精，并用高压灭菌的蒸馏水冲洗样品三次，为了查验名义无菌性，每次不休将一块组织暂时遗弃在无菌 R2A 琼脂板上，在 25°C 下孵育 10 ，将名义消毒的根放入高压灭菌的研钵中，并通过用无菌陶瓷杵压碎来研磨，HPO 缓冲液和这种“根汁”被倒入一个极新的试管中，然后冷冻以供随后的 DNA 索求。

为了收罗精子球，将 Lenha 和 EMBRAPA 基因型各 5 个种子浸泡在 5 mL 含有 0.1% Tween 20 的无菌 50 mM 磷酸钾缓冲液中 24 小时，然后用手移时摇动，然后在 T7 型超声水浴中以 22.5 kHz 超声不休 10 分钟，以去除种子名义的微生物，将所得种子洗液在 4°C 下以 15，000 g 离心 15 分钟进行浓缩，倾析出上清液，将千里淀悬浮在 500 μL 极新磷酸盐缓冲液中，然后冷冻以供后续 DNA 索求。

植物组织和泥土中的 DNA 索乞降末端末端性片断长度多态性 (TRFLP)

使用 PowerSoil? DNA 辩别试剂盒从每种泥土的 3 个样品以及每组叶际、根际、精子层和根内圈的 5 个样品中索求总 DNA，使用 Nanodrop对 DNA 进行定量。

使用以下标准在 PTC200 DNA 热轮回仪中进行 35 个轮回的扩增：96°C 3 分钟，35X（94°C 30 秒，48°C 30 秒，72°C 1:30 分钟），72°C 7 分钟。

选用正向引物 799 F 是因为它强横偏向于扩增叶绿体 16S rDNA；放大和末端后，但在进行统计分析之前，更大的线粒体 18S 片断随后被通过策画机去除。

通过使用引物 799f 和 1389r 将 10 ng DNA 扩增 40 倍，对根际、精子层、泥土和水样进行无巢式扩增。然后将 1.5 μl 标识的 PCR 家具添加到 8.5 μl 末端性搀和物中，并在 37 °C 下灰阴郁孵育 16 小时，然后使用 3730 DNA 分析仪和 GeneScan 1200 LIZ 尺寸模范品通过测序凝胶进行分析，每个基因型/不休组合有 5 个生物相通，每个泥土有 3 个相通。

根际样品的 MiSeq 分析

PCR 扩增使用通用细菌 16S rDNA 引物 515 F 和 806R 进行，遵照先前发布的决策，其中每个模板分子在通过 PCR 指数扩增之前通过线性扩增格局被赋予独有的序列或分子标签，将抗叶绿体和抗线粒体肽核酸 (PNA) 阻断剂添加到 PCR 响应中，以阻断叶绿体和线粒体的扩增。

使用 MT-Toolbox 软件不休序列读数，该软件从带有相易分子标签的两个或多个序列中生成共有序列 (conseq)，从而矫正序列舛错和偏差。仅使用代表两个或多个原始读数的 conseq 进行分析。然后使用 USEARCH 6 将 Conseq 以 97% 序列相通性阈值分类为操作分类单元 (OTU) ，并使用剧本为 OTU 分拨分类身份，其中 RDP 分类器在洛斯阿拉莫斯国度施行室的 GreenGenes 分类参考文献上进行了教养。

在 QIIME v1.5.0 包中，OTU 计数导出至 Excel进行进一步分析，并当作“Raw Conseq Counts”包含在电子补充材料中，Miseq 不雅察到的 1059 个 OTU 序列当作 FASTA 文献“OTU 序列”包含在电子补充材料中。

论断

通过相比在无菌沙子中助长的根际中发现的细菌种群，与在地下深处微生物短缺的泥土中助长的植物以及亚马逊森林中富含微生物的表土中助长的植物的细菌种群，咱们的数据标明，在这个生态位中发现的大宽敞细菌细胞来自种子，要么当作里面的内生菌，要么当作名义的附生菌，两个玉米品种之间根际细菌万般性互异的字据不错评释为基因型效应或种子不休效应。

天然，泥土确乎加多了玉米根际住户的万般性，但只孝顺了少许的多种不同细菌属，而不是在该生态位中装配上风群体，既莫得泥土，基因型似乎也不影响叶际或根内圈细菌种群，尽管对较陈腐或遗传上不同的植物进行的施行可能会显现出不同的成果，咱们的数据标明，试图更动和优化玉米根际以匡助抗病和抗逆、营养获取和根部发育的科学家和农民，要是他们汇集元气心灵干与种子关系的微生物组而不是泥土微生物组，可能会更奏效。

参考文献

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